芒果象甲DNA提取方法

芒果象甲dna提取方法

技术领域

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种芒果象甲dna提取方法。

背景技术：

2.芒果(mangifera indica l.)系漆树科芒果属常绿乔木，享有“热带水果之王”的美誉。芒果象甲为鞘翅目象甲科害虫，分为芒果切叶象甲、芒果果肉象甲、芒果果实象甲和芒果果核象甲四大类，前者主要为害嫩叶，后三者被我国列入二类危险性害虫名单，是植物检疫的重点对象，主要为害果实、果肉，给芒果产业造成极大地损失。

3.当前对芒果象甲的研究大多停留在形态观察和生物学习性观测方面，对芒果象甲的分子鉴定、分子抗性机理等分子生物学研究处于初级探索阶段，因此为了克服传统形态学研究的不确定性和局限性，迫切需要进一步开展芒果象甲分子生物学研究，以便快速准确识别不同类型的芒果象甲，了解芒果象甲的抗性机制，而后对症下药。

4.dna提取是开展芒果象甲分子生物学研究的重要环节，当前多采用经典的酚氯仿方法提取昆虫dna。实验结果表明，该方法用于提取芒果象甲dna时存在提取率低，含有较多蛋白质、酚类物质等问题，影响后续的pcr扩增，易导致实验失败，因此迫切需要探索出一种快速高效的芒果象甲dna提取方法。

技术实现要素：

5.本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

6.本发明的一个目的是提供一种芒果象甲dna提取方法，其可以提高对芒果象甲dna的提取纯度和质量。

7.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种芒果象甲dna提取方法，包括：

8.步骤一、液氮研磨：选取芒果象甲虫体，去除所述芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织；根据所述胸脯肌肉组织的大小选取容积相匹配的研磨容器；在所选取的研磨容器内利用液氮将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品；

9.步骤二、裂解消化：在dna裂解液中加入蛋白酶k，对所述粉末状样品进行裂解消化；

10.步骤三、醇沉：利用无水乙醇对经过裂解消化处理的样品进行处理；

11.步骤四、洗脱：对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集dna；

12.步骤五、清除rna：向所收集的dna中加入rnasea，清除rna。

13.优选的是，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤一中，所述所选取的研磨容器为2ml离心管或中号规格的研钵。

14.优选的是，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤二中，所述在dna裂解液中加入蛋白酶k，对所述粉末状样品进行裂解消化，其具体过程包括：

15.步骤(1)加dna裂解液a消化：向所述粉末状样品中加入180μl dna裂解液a以及20μl蛋白酶k，充分混匀；其中，所述dna裂解液a为基因组dna小量抽提试剂盒中的成分；

16.步骤(2)水浴：在55℃条件下水浴孵育1～3h至完全裂解，中间每隔15min轻微摇匀一次；

17.步骤(3)加dna裂解液b消化：加入200μl dna裂解液b，充分混匀，在70℃条件下水浴10min，其中，所述dna裂解液b为所述基因组dna小量抽提试剂盒中的成分。

18.优选的是，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤四中，所述对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集dna，其具体过程包括：

19.步骤(1)第一次洗脱：将所述经过醇沉处理的样品加入到dna纯化柱，使沉淀全部转移，12000rmp离心1min，弃废液，加入500μl洗涤液i，12000rmp离心1min，弃废液；

20.步骤(2)第二次洗脱：加入600μl洗涤液ii，12000rmp离心1min，倒废液，12000rmp离心1min；

21.步骤(3)收集dna：将所述dna纯化柱置于1.5ml离心管上，加入100μl的洗脱液，室温放置3min，12000rmp离心1min，所得液体即为纯化的dna；其中，所述洗涤液i、所述洗涤液ii和所述洗脱液均为所述基因组dna小量抽提试剂盒中的成分。

22.优选的是，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤五中，向所收集的dna中加入2μl 100mg/ml rnasea，混匀，室温下放置2min。

23.优选的是，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤一中，所选取的芒果象甲虫体为由纯酒精浸泡的虫体；所述去除芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织之后，将所述胸脯肌肉组织用无菌水进行冲洗，去除残余的酒精。

24.优选的是，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤(2)中，在水浴过程中，在两次轻微摇匀的中间进行超声处理，其中，超声功率为80w，超声1s；所述步骤(3)中，在dna裂解液b消化过程中，进行超声处理，其中，超声功率为60w，超声1s，停歇2min，循环至水浴结束。

25.优选的是，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤一中，所述在所选取的研磨容器内利用液氮将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品，其具体过程包括：

26.步骤(1)向所述所选取的研磨容器中加入液氮，利用液氮对所选取的研磨容器和研磨棒进行预冷却；

27.步骤(2)将所述胸脯肌肉组织放入所述所选取的研磨容器中，快速研磨，每研磨20s向所述所选取的研磨容器中补充液氮，直至将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到所述粉末状样品。

28.本发明至少包括以下有益效果：

29.(1)根据虫体大小选用容积相匹配的研磨容器进行液氮研磨，可使研磨更精细、更充分，提高dna释放量。

30.(2)去掉芒果象甲成虫的鞘翅，选取胸脯肌肉组织，可提高研磨质量。

31.(3)dna裂解液中加入蛋白酶k，可以消除蛋白质对dna的干扰，从而提高提取纯度和质量。

32.(4)本发明所提供的方法对传统提取方法进行改良，可获得高纯度、高质量的芒果象甲dna，为保证芒果象甲分子生物学研究顺利开展奠定基础。

33.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

34.图1为本发明一个实施例所述的芒果象甲dna提取方法的示意图；

35.图2为本发明实施例1所述的2只芒果象甲dna的凝胶电泳检测图；

36.图3为本发明实施例2所述的2只芒果象甲dna的凝胶电泳检测图。

具体实施方式

37.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

38.如图1所示，本发明提供了一种芒果象甲dna提取方法，包括：

39.步骤一、液氮研磨：选取芒果象甲虫体，去除所述芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织；根据所述胸脯肌肉组织的大小选取容积相匹配的研磨容器；在所选取的研磨容器内利用液氮将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品。

40.实验发现，研磨对dna提取的影响较大。因此，根据虫体大小选用容积相匹配的研磨容器进行液氮研磨，可使研磨更精细、更充分，提高dna释放量，进而提高dna的提取率。在一个优选的实施例中，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤一中，所述所选取的研磨容器为2ml离心管或中号规格的研钵。优选地，芒果切叶象甲成虫虫体较小，利用与离心管匹配的小杵研磨质量较好，而芒果果肉象甲、果核象甲和果实象甲利用中号规格研钵研磨效果较好。

41.此外，在选取芒果象甲虫体时，去掉芒果象甲成虫的鞘翅，选取胸脯肌肉组织，可提高研磨质量。

42.步骤二、裂解消化：在dna裂解液中加入蛋白酶k，对所述粉末状样品进行裂解消化。

43.实验发现，蛋白质对dna纯度的影响较大。芒果象甲体内的蛋白质含量较高，常规的酚氯仿抽提难以将其消除。基于此，本发明实施例利用蛋白酶k消解芒果象甲体内的蛋白质，来达到提高dna提取纯度的目的。

44.步骤三、醇沉：利用无水乙醇对经过裂解消化处理的样品进行处理。

45.步骤四、洗脱：对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集dna。

46.步骤五、清除rna：向所收集的dna中加入rnasea，清除rna。

47.这里，步骤五之后，还可以包括步骤：检测：利用凝胶电泳对所提取到的dna进行检测。

48.综上所述，本发明重点解决两个关键的技术问题：一、选择合适的研磨工具，弃除较坚硬的器官，选取适当的肌肉组织，解决研磨不充分的问题，提高芒果象甲体内dna的释放量；二、利用适量的蛋白酶k消解芒果象甲体内的蛋白质，提高dna提取纯度。本发明对传统提取方法进行改良，获得高纯度、高质量的芒果象甲dna，为保证芒果象甲分子生物学研究顺利开展奠定基础。

49.具体地，本发明使用基因组dna小量抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)

实现对于芒果象甲dna的提取，建立一种快速有效的芒果象甲dna提取方法，其操作方法包括：(1)液氮研磨；(2)裂解液消化；(3)醇沉；(4)洗涤液洗脱；(5)rnasea清除rna；(6)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

50.在一个优选的实施例中，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤二中，所述在dna裂解液中加入蛋白酶k，对所述粉末状样品进行裂解消化，其具体过程包括：

51.步骤(1)加dna裂解液a消化：向所述粉末状样品中加入180μl dna裂解液a以及20μl蛋白酶k，充分混匀；其中，所述dna裂解液a为基因组dna小量抽提试剂盒中的成分；

52.步骤(2)水浴：在55℃条件下水浴孵育1～3h至完全裂解，中间每隔15min轻微摇匀一次，以便充分裂解；

53.步骤(3)加dna裂解液b消化：加入200μl dna裂解液b，充分混匀，在70℃条件下水浴10min，其中，所述dna裂解液b为所述基因组dna小量抽提试剂盒中的成分。

54.在一个优选的实施例中，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤四中，所述对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集dna，其具体过程包括：

55.步骤(1)第一次洗脱：将所述经过醇沉处理的样品加入到dna纯化柱，使沉淀全部转移，12000rmp离心1min，弃废液，加入500μl洗涤液i，12000rmp离心1min，弃废液；

56.步骤(2)第二次洗脱：加入600μl洗涤液ii，12000rmp离心1min，倒废液，12000rmp离心1min，除去残留乙醇；

57.步骤(3)收集dna：将所述dna纯化柱置于1.5ml离心管上，加入100μl的洗脱液，室温放置3min，12000rmp离心1min，所得液体即为纯化的dna；其中，所述洗涤液i、所述洗涤液ii和所述洗脱液均为所述基因组dna小量抽提试剂盒中的成分。

58.在一个优选的实施例中，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤五中，向所收集的dna中加入2μl 100mg/ml rnasea，混匀，室温下放置2min。

59.在一个优选的实施例中，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤一中，所选取的芒果象甲虫体为由纯酒精浸泡的虫体；所述去除芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织之后，将所述胸脯肌肉组织用无菌水进行冲洗，去除残余的酒精。

60.在一个优选的实施例中，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤(2)中，在水浴过程中，在两次轻微摇匀的中间进行超声处理，其中，超声功率为80w，超声1s；所述步骤(3)中，在dna裂解液b消化过程中，进行超声处理，其中，超声功率为60w，超声1s，停歇2min，循环至水浴结束。超声处理有助于促进充分裂解，同时相对温和的超声处理条件也可以避免导致dna断裂。而且，步骤(3)中超声处理条件相较于步骤(2)水浴过程中的条件更为温和，可以在保证促进反应的同时，避免dna断裂。

61.在一个优选的实施例中，所述的芒果象甲dna提取方法中，所述步骤一中，所述在所选取的研磨容器内利用液氮将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品，其具体过程包括：

62.步骤(1)向所述所选取的研磨容器中加入液氮，利用液氮对所选取的研磨容器和研磨棒进行预冷却；

63.步骤(2)将所述胸脯肌肉组织放入所述所选取的研磨容器中，快速研磨，每研磨20s向所述所选取的研磨容器中补充液氮，直至将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到所述粉末状样品。

64.其中，对研磨容器和研磨棒进行预冷却的情况下，当样品放入研磨容器内，可以更快速地进入冷冻状态，进而提高研磨的质量和效率。并且，在研磨过程中，每间隔一定时间向研磨容器补充液氮，以保证样品始终处于冷冻状态，避免dna降解。

65.以下提供三个实施例，以进一步说明本发明所提供的技术方案。

66.实施例1

67.本实施例中芒果象甲dna提取方法包括：

68.(1)研磨：将纯酒精浸泡的虫体，选择适当大小的肌肉组织，用无菌水进行冲洗，去除残余的酒精，冲洗干净后，用液氮将组织充分研磨成粉末状，转置2.0ml离心管。

69.(2)加dna裂解液消化：加入180μldna裂解液a及20ul蛋白酶k，充分混匀。

70.(3)水浴：55℃水浴孵育1h至完全裂解，中间每隔15min轻微摇匀一次，以便充分裂解。

71.(4)加dna裂解液进一步消化：加入200μldna裂解液b，充分混匀，70℃水浴10min。

72.(5)醇沉：加入200μl无水乙醇沉淀，充分混匀。

73.(6)第一次洗脱：把混合物加入到dna纯化柱，注意必须把沉淀全部转移，12000rmp离心1min，弃废液，加入500μl洗涤液i，12000rmp离心1min，弃废液。

74.(7)第二次洗脱：加入600μl洗涤液ii，12000rmp离心1min，倒废液，12000rmp离心1min，除去残留乙醇。

75.(8)收集dna：将dna纯化柱置于1.5ml离心管上，加入100μl的洗脱液，室温置放3min，12000rmp离心1min，所得液体即为纯化的dna。

76.(9)清除rna：加入2μl 100mg/ml rnasea混匀，室温置放2min。

77.(10)检测：采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，后置于-20℃冰箱保存备用。图2为从2只芒果象甲成虫中提取的dna的凝胶电泳检测图。由图2可见，dna条带单一，没有出现弥散，说明本实施例可以从芒果象甲成虫中提取到高质量、高纯度的dna。

78.实施例2

79.本实施例中芒果象甲dna提取方法包括：

80.(1)研磨：将纯酒精浸泡的虫体，选择适当大小的肌肉组织，用无菌水进行冲洗，去除残余的酒精，冲洗干净后，用液氮将组织充分研磨成粉末状，转置2.0ml离心管。

81.(2)加dna裂解液消化：加入180μldna裂解液a及20ul蛋白酶k，充分混匀。

82.(3)水浴：55℃水浴孵育3h至完全裂解，中间每隔15min轻微摇匀一次，以便充分裂解。

83.(4)加dna裂解液进一步消化：加入200μldna裂解液b，充分混匀，70℃水浴10min。

84.(5)醇沉：加入200μl无水乙醇沉淀，充分混匀。

85.(6)第一次洗脱：把混合物加入到dna纯化柱，注意必须把沉淀全部转移，12000rmp离心1min，弃废液，加入500μl洗涤液i，12000rmp离心1min，弃废液。

86.(7)第二次洗脱：加入600μl洗涤液ii，12000rmp离心1min，倒废液，12000rmp离心1min，除去残留乙醇。

87.(8)收集dna：将dna纯化柱置于1.5ml离心管上，加入100μl的洗脱液，室温置放3min，12000rmp离心1min，所得液体即为纯化的dna。

88.(9)清除rna：加入2μl 100mg/ml rnasea混匀，室温置放2min。

89.(10)检测：采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，后置于-20℃冰箱保存备用。图3为从2只芒果象甲成虫中提取的dna的凝胶电泳检测图。由图3可见，dna条带单一，没有出现弥散，说明本实施例可以从芒果象甲成虫中提取到高质量、高纯度的dna。

90.实施例3

91.本实施例中芒果象甲dna提取方法包括：

92.(1)研磨：将纯酒精浸泡的虫体，选择适当大小的肌肉组织，用无菌水进行冲洗，去除残余的酒精。冲洗干净后，向研磨容器中加入液氮，利用液氮对所选取的研磨容器和研磨棒进行预冷却，将胸脯肌肉组织放入所选取的研磨容器中，快速研磨，每研磨20s向所选取的研磨容器中补充液氮，直至将胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品，转至2.0ml离心管。

93.(2)加dna裂解液消化：加入180μldna裂解液a及20ul蛋白酶k，充分混匀。

94.(3)水浴：55℃水浴孵育1h至完全裂解，中间每隔15min轻微摇匀一次，在两次轻微摇匀的中间进行超声处理，其中，超声功率为80w，超声1s。

95.(4)加dna裂解液进一步消化：加入200μldna裂解液b，充分混匀，70℃水浴10min，进行超声处理，超声功率为60w，超声1s，停歇2min，循环至水浴结束。

96.(5)醇沉：加入200μl无水乙醇沉淀，充分混匀。

97.(6)第一次洗脱：把混合物加入到dna纯化柱，注意必须把沉淀全部转移，12000rmp离心1min，弃废液，加入500μl洗涤液i，12000rmp离心1min，弃废液。

98.(7)第二次洗脱：加入600μl洗涤液ii，12000rmp离心1min，倒废液，12000rmp离心1min，除去残留乙醇。

99.(8)收集dna：将dna纯化柱置于1.5ml离心管上，加入100μl的洗脱液，室温置放3min，12000rmp离心1min，所得液体即为纯化的dna。

100.(9)清除rna：加入2μl 100mg/ml rnasea混匀，室温置放2min。

101.(10)检测：采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，后置于-20℃冰箱保存备用。经检测发现，dna条带单一，没有出现弥散，说明本实施例可以从芒果象甲成虫中提取到高质量、高纯度的dna。

102.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。